一、疾病概述

人体受到辐射事故照射或者肿瘤患者放射治疗时，造血系统是辐射损伤敏感的靶器官。在接受到亚致死剂量照射后，不仅出现急性放射病，表现为全血下降、出血、感染等急性骨髓抑制表现；急性损伤的救治主要是细胞因子提高造血能力及支持疗法。部分患者经过治疗后还会出现远期损伤，表现为持续性骨髓抑制，由于起病隐匿，没有有效治疗方法，预后不良。

二、模型背景

1、实验动物背景信息

FVB/N及C57BL/6J的FOXO3A-/-小鼠，由中国医学科学院医学实验动物研究所张连峰教授课题组提供。

2、研究背景

FOXOs转录因子家族包括FOXO1、FOXO3A、FOXO4、FOXO6四个成员 [1]， FOXO3A 转录因子又名横纹肌肉瘤样1叉头框（Forkheadrhabdomyosarcoma like1，FKHRL1），广泛参与造血细胞内抗氧化应激调节过程，维持造血系统稳态 [2-4]。

前期研究发现FOXOs（FOXO1，FOXO3，FOXO4）基因敲除小鼠出现明显的HSCs异常，表现为HSCs数量和长期重建能力显著降低。给予抗氧化剂乙酰半胱氨酸（Acetylcysteine，NAC）治疗能够恢复HSCs异常改变[5]，FOXOs也能够通过调节SOD和CAT的表达调节HSCsROS的产生 [6]，这提示FOXOs通过调节氧化应激维持HSCs稳态。同时有实验证实FOXO3A在HSCs中特异性转录激活，FOXO3A基因敲除小鼠可以重现FOXOs基因敲除小鼠HSCs异常表型 [2, 7]，这表明FOXO3A是HSCs稳态最主要的调节因子。前期也有研究发现FOXO3A基因缺陷小鼠随年龄增长或在给予抗肿瘤化疗药5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU）诱导的造血细胞恢复过程中，表现为中性粒细胞增多，造血干细胞中AKT、ERK激活及增殖抑制蛋白Spred2（Sprouty-relatedEna/VASP homology 1 domain-containing proteins 2）和周期蛋白依赖激酶（Cyclin-dependent kinase，CDK）抑制剂p27Kip1表达下调，认为在应激和衰老情况下，FOXO3A通过负反馈调节拮抗AKT和ERK通路，维持HSCs稳态[8]，同时也有研究证明FOXO3A通过调节毛细血管扩张性共济失调突变（Ataxiatelangiectasia mutated，ATM）基因和抗氧化酶系的表达调节HSCs中ROS水平，维持HSCs功能 [9]。近来研究发现由范科尼贫血蛋白2 (Fanconi anemia protein2, Fancd2)基因介导的DNA损伤修复通路与FOXO3A基因介导的应激调节通路在HSCs维持上存在功能性协同调节作用 [10]，为应激诱导的HSCs衰竭等血液疾病治疗开辟了新的靶点。由此，FOXO3A参与的机体抗氧化应激调节在HSCs稳态调节上发挥至关重要的作用。

有关FOXO3A在辐射引起的急性和远期损伤中的作用有待于进一步验证。

参考文献

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[2] Miyamoto K, Araki KY, Naka K, et al. Foxo3a IsEssential for Maintenance of the Hematopoietic Stem Cell Pool[J]. Cell stemcell, 2007, 1(1): 101-112.

[3] Kana M, Takeshi M, Reiko K, et al. FoxO3aregulates hematopoietic homeostasis through a negative feedback pathway inconditions of stress or aging[J]. Blood, 2008, 112(12): 4485-4493.

[4] Warr MR, Mikhail B, Johanna F, et al. FOXO3Adirects a protective autophagy program in haematopoietic stem cells[J]. Nature,2013, 494(7437): 323-327.

[5] Tothova Z, Kollipara R, Huntly BJ, et al. FoxOsare critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologicoxidative stress[J]. Cell, 2007, 128(2): 325-339.

[6] Safak Y, Xin Z, Luciano JP, et al. Foxo3 isessential for the regulation of ataxia telangiectasia mutated and oxidative stress-mediatedhomeostasis of hematopoietic stem cells[J]. J Biol Chem, 2008, 283(37): 25692.

[7] Yalcin S, Zhang X, Luciano JP, et al. Foxo3 isessential for the regulation of ataxia telangiectasia mutated and oxidativestress-mediated homeostasis of hematopoietic stem cells[J]. J Biol Chem, 2008,283(37): 25692-25705.

[8] Li X, Zhang T, Wilson A, et al. Transcriptionalprofiling of Foxo3a and Fancd2 regulated genes in mouse hematopoietic stemcells[J]. Genom Data, 2015, 4(C): 148-149.

[9] Guoshun X, Hongying W, Junling Z, et al. Metforminameliorates ionizing irradiation-induced long-term hematopoietic stem cellinjury in mouse[J]. Free Radic Biol Med, 2015, 87(1): 15-25.

[10] Rehman A, Kim Y, Kim H, et al. FOXO3a expressionis associated with lymph node metastasis and poor disease-free survival intriple-negative breast cancer[J]. J Clin Pathol, 2018, 71(9): 806-813.

（一）实验材料

1. 实验动物

FOXO3A基因敲除FVB/N小鼠（FOXO3A+/-）由中国医学科学院医学实验动物研究所张连峰教授课题组保存（store number：016132-UCD），雌性小鼠4只，SPF级，体重16~18g，5周龄；野生型雄性FVB/N小鼠2只，SPF级，体重16~18g， 5周龄，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供［SCXK（京）2016-0011］; FOXO3A基因敲除C57BL/6J小鼠（FOXO3A+/-）由中国医学科学院医学实验动物研究所张连峰教授课题组通过CRISPR/Cas9基因编辑技术制备，雌性小鼠5只，SPF级，体重15g，4周龄；野生型雄性C57BL/6J小鼠5只，SPF级，体重18~20g， 6~8周龄，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供［SCXK（京）2014-0004］。实验方案通过中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物管理和使用委员会（IACUC）审批，IACUC号为：MAM17002。实验动物饲养繁育和实验过程中，在不影响实验要求和实验结果的基础上，严格按实验动物使用的3R原则（减少、替代、优化）关注实验动物福利。

2. 试剂与仪器

EDTA-K3购自Sigma公司，甲基纤维素培养基购自Stem cellTechnologies公司，流式抗体CD4、CD8、B220、Ter119、Gr-1、CD11b、Streptavidin、scal-1、ckit均购自BD Bioscience和 eBioscience公司；X-RAD 225高能量生物学X射线辐照仪（美国）， FACS AriaTMⅡ流式细胞仪（BDBioscience）， DX120全自动血液分析仪（ABX PENTRA）， CKX41倒置显微镜（奥林帕斯）。

（二）实验方法

1.小鼠分组和照射

小鼠均分为四组：野生型小鼠对照组（WT组），FOXO3A-/-小鼠对照组（FOXO3A-/-组），野生型小鼠照射组（WT+IR）, FOXO3A-/-小鼠照射组（ FOXO3A-/-+IR），分别接受假照射和4GyX-线全身照射（TBI），照射剂量率为0.9Gy/min。接受TBI小鼠于SPF级动物房中饲养，每天观察记录体重变化。

2.小鼠外周血常规检测

小鼠TBI 后14d小鼠眼眶静脉丛取血，抗凝管收集外周血，全自动血液分析仪测定外周血中白细胞数（WBC）、红细胞数（RBC）、血红蛋白含量（HGB）和血小板（PLT）等指标。

3.小鼠胸腺、脾脏指数测定

小鼠TBI后14d称重安乐死，取胸腺、脾脏并称重，计算脏器指数，脏器指数=脏器(mg)/体重(g)。

4.骨髓细胞有核细胞计数

小鼠TBI后14d，无菌分离小鼠胫骨和股骨，剔除肌肉，注射器冲洗骨髓细胞，过滤后采用KOVA一次性计数板，显微镜下人工骨髓计数。最终细胞计数结果以每只小鼠×107个细胞表示。

5.小鼠骨髓细胞表型分析

小鼠TBI后14d，收集骨髓细胞至流式管，加入Biotin标记的混合一抗抗体（CD4、CD8、B220、Ter119、Gr1、cd11b），孵育后洗涤并重悬细胞，加入混合二抗抗体streptavidin（percp标记）、scal-1（PE标记）、ckit（APC标记），孵育后洗涤并重悬细胞。流式细胞仪检测HPCs（Lin− c-kit+ Sca1−or LSK- cells），HSCs（Lin− c-kit+ Sca1+or LSK+ cells） [19]在骨髓中所占的比例。

6.粒细胞巨噬细胞集落形成单位（Clony forming unit-granulocyte and macrophage，CFU-GM）测定 [6]

小鼠TBI 后14d安乐死，分离骨髓细胞并分组混合，每组接种40000个细胞到分装好的2ml的3534培养基中。按操作说明进行后续接种。接种细胞培养5~7d后于倒置显微镜下读取CFU-GM数，细胞数≥50为阳性集落。结果换算为每105个BMNCs中CFU-GM的个数。

7.统计学方法

对数据进行分析方差分析（ANOVA）。组间方差分析比较时，使用用于多重比较的theStudent–Newman–Keuls test。两组计量资料比较时使用非配对Student's t 检验，差异P<0.05时认为具有统计学意义。所有这些分析使用GraphPadPrism软件(SanDiego，CA，USA)。

1. FOXO3A缺陷小鼠受照后外周血计数检测

FOXO3A缺陷小鼠接受4Gy TBI，2w后全自动血液分析仪测定外周血，发现白细胞数（WBC）、红细胞数（RBC）、血红蛋白含量（HGB）、血小板（PLT）下降，与野生型小鼠变化没有差异。

2.FOXO3A缺陷小鼠受照后骨髓细胞计数检测

FOXO3A缺陷小鼠接受4GyTBI，2w后检测单侧骨髓细胞计数，发现FOXO3A缺陷小鼠低于野生型对照小鼠；受照后FOXO3A缺陷小鼠骨髓细胞计数下降幅度低于野生型对照。

3.FOXO3A缺陷小鼠免疫脏器系数

FOXO3A缺陷小鼠免疫脏器系数与野生型对照未见差异；受照后改变未见差异。

4.FOXO3A缺陷小鼠骨髓细胞分型检测

骨髓细胞分型检测发现，FOXO3A缺陷小鼠体内HPCs 比例升高；接受4 Gy X 射线TBI 后14 d,FOXO3A-/ -受照小鼠出现HSCs、HPCs 比例和数目下降程度，高于野生型对照。

5.FOXO3A缺陷小鼠造血祖细胞增殖功能测定

CFU-GM检测发现FOXO3A缺陷小鼠造血祖细胞增殖能力与野生型对照没有差异；接受4Gy X 射线TBI 后14 d, FOXO3A缺陷小鼠未见明显降低。

在诱导模型过程中，照射设备具有自身屏蔽装置，使用安全，不会对人体及环境造成任何影响。

该模型在研究辐射损伤及机体老龄化相关的损伤中具有广泛的应用价值。国内已有相关单位咨询引用。